无菌工艺快速微生物检测方法

GMP行业新闻2020-05-21 15:56:08

与常规微生物检测技术相比,快速微生物检测技术自动化或微型化程度高,提高了检测通量,更灵敏、更准确、更精确,重现性好,可明显缩短检测时间,某些技术还可实现实时检测。微生物检测数据的实时获得,使得实验室的被动模式变为主动模式,可在正常生产操作期间,了解工艺过程和成品是否被污染。

自21世纪初以来,国际制药工业界在无菌药品生产领域开展了一项重要的检测技术——快速微生物检测(RMM,Rapid Microbiological Methods),包含快速检出和鉴定。

在多年制药工业实践中,许多实验室发现当微生物养分被剥夺,或抗菌剂,如防腐剂、消毒剂、高温蒸汽或去污染气体的浓度达亚致死量时,微生物会发生应激,无法在传统人工介质上复制培养。因为这种培养不能达到最佳复活条件,微生物不能增殖。当这种情况发生时,无菌培养阴性不能证明产品没有受到污染。另外,无菌培养需时较长,不能实时发现产品生产过程中发生的污染,不能使产品快速放行,增加仓储时间和成本。于是,人们希望开发出新的微生物检查、定量和鉴定方法。

近年来生物检测技术高速发展并迅速向制药领域渗透。当前RMM各类技术平台已经能够检测到多种微生物及变异微生物;能明确样品中微生物的数目;识别微生物的属,种和亚种。这些技术主要分为基于微生物培养的快速发现和鉴定技术、活细胞识别鉴定技术和基因及芯片识别鉴定技术。

基于微生物培养的快速发现和鉴定技术

基于微生物培养的快速发现和鉴定技术是在微生物培养过程中早期快速发现微生物生长。

电阻监测系统能测量微生物生长过程中液体介质中电势的变化。微生物生长过程中,较大的,不带电的分子分解为较小的,高度带电的分子,如蛋白质变成氨基酸,脂肪变成脂肪酸,多糖变成乳酸等。通过监测电极间离子移动(电导率)或电极表面电荷数量(电容),检查是否有微生物生长。bioMérieux Bactometer系统就是基于这一原理。

微生物液体培养时会产生CO2,在密闭容器中,可通过监测容器中CO2含量的变化来检测微生物生长。BacT/ALERT系统设备是bioMérieux的第二代技术。该技术将微生物生长产生的二氧化碳扩散至液体乳胶传感器,触发颜色警报器,告知用户检测到微生物。Genzyme Biosurgery已将这种技术用于其细胞培养产品的快速无菌检查。

所有活的细胞都以ATP(Adenosine Triphosphate)的形式储存能量。当ATP转化为AMP(Adenosin Monophosphate)时会发生生物发光现象。因此,人们可利用检测细胞ATP来证明微生物存活情况。可利用ATP释放剂提取样品中微生物细胞中的ATP,然后加入反应剂,检测样品中的发光量。根据所测光量判断微生物的存在情况,或指出光量与实际细胞数的相关性。如果样品中微生物水平非常低,则需要先在液体介质或琼脂上进行复制,以增加ATP含量,从而便于检测。Millipore's Milliflex快速检测系统设备、Celsis Advance Luminometer、PallChek微生物学系统设备均是根据这一原理进行检测。

研究发现,所有微生物细胞都存在自发荧光光谱。这与细胞内黄素类如核黄素、黄素蛋白等物质有关。Growth Direct系统设备用于快速检测琼脂表面是否有微生物生长。可较早检测到小菌落发出的黄绿色荧光。

微生物代谢时可利用某些生化物质和碳水化合物。利用这一机制,Biolog Omnilog系统设备在反应井中放有含有脱水碳源的四唑紫染料,如果微生物利用这种碳源,则该井变紫色。利用不同波长可见光监测每个井的变化,检测浊度(微生物生长引起)或代谢产物的颜色。系统产生的数据结果,通常用“+/-”表示,与内部数据库或相关图书馆提供的特异平台和微生物鉴别结果相比较。

活细胞检测技术

利用这类技术可区分活细胞和死细胞。可使用针对特异微生物的核酸、酶、单克隆抗体探针,直接给单个细胞标记,不需介质培养。多用于检测和/或定量测定孢子、应激细胞、需复杂营养的微生物、活的、不能培养的微生物。标记可在数小时甚至数分钟完成,几乎可获得实时结果。

常用的有流式细胞仪和固相细胞仪。流式细胞仪是将标记过的细胞液样品放入检测腔,让样品中的细胞形成细胞束逐个快速流经有激光束照射的腔室,发出荧光和光散射信号的为活细胞,可以计数。标记和检测可在15min内完成。所需样品量少,不超过1 mL。市售设备有Chemunex D-Count和BactiFlow系统等。

固相细胞检测仪如Chemunex ScanRDI系统设备是让样品通过涂有特定物质的过滤器,这种物质可被活细胞代谢时细胞质中的酶分解,分解释放荧光剂,标记活细胞。接着整个细胞表面进行激光扫描,完成标记微生物的定量测定。系统完成标记和检测工艺大约需要90min。系统也可在数小时内,利用抗体和核酸探针进行特异微生物的检测和定量测定。

与传统的介质培养法相比,利用这种技术获得的微生物数量更多,更适宜用于环境应激类微生物即暴露在消毒剂或防腐剂中的微生物的检测。

基因及芯片识别鉴定技术

基因识别鉴定是指利用基因扩增和检测平台,包括聚合酶链反应(PCR)、转录介导扩增(TMA)、16S rRNA分析、基因测序等方法进行的快速微生物检测和鉴定。这些方法大多数用于检测某种特异微生物是否存在以及菌落的鉴别,可快速鉴定到属、亚种和或系水平。这些方法需经细胞培养得到起始原料,如琼脂表面的一个菌落,因此获得最终结果的时间包括细胞培养的时间。

聚合酶链反应(PCR)是基因检测的基本技术。利用小的DNA片段即引物,在Taq DNA聚合酶作用下,能使目标序列进行数百万次复制,便于被检测,用于确定样品中是否存在某种特异微生物。

PCR和MS结合用于检测和鉴别微生物,可以非常准确地知道每种含有DNA的底物的精确质量,因此可通过质谱对源于底物的PCR目标序列进行高精度的测定。Sequenom MassARRAY设备利用各种序列引物进行微生物鉴别。序列包括看家基因(多位点序列分型MLST)和16S rDNA。

转录介导扩增(TMA)采用单链RNA,通过T7 RNA聚合酶,每个周期产生数千个RNA扩增子,在15~30min内可完成10亿次复制,其效率远高于PCR。与PCR相比,利用TMA技术的其他优势还有:每个细胞只有唯一的DNA靶标,却有数千个rRNA复制品,提高了命中靶标的可靠性;TMA酶对干扰的敏感度低于PCR酶;TMA时只需41℃时恒温反应,无需PCR所用的昂贵的热循环仪;RNA扩增子比DNA扩增子更易分解,明显降低了因其他有机体、非活性细胞或染色体DNA造成的假阳性结果;TMA操作简单,能在一根软管中完成,无需冲洗。目前Millipore和Gen-Probe合作研发MilliPROBE设备,采用TMA技术,利用分子信标(一种扩增检测探针)进行目标物检测,利用新技术-磁性玻璃珠定向捕获目标物。

16S rRNA序列在属和种水平上高度保守。rRNA操纵子内(16S序列的间隔区和侧翼区)的非保守片段能用于特异种内系的区别。DuPont Qualicon RiboPrinter设备利用编译rRNA的DNA序列进行微生物及系的鉴别。这个系统中,限制性内切酶,如EcoRI或PvuⅡ将DNA拆分,双链DNA变成单链DNA后,滤膜与源于E. coli rRNA操纵子的DNA探针杂交。加入化学发光试剂,捕获能发光的碎片,形成图谱并与系统数据库图谱比对。这种图谱也可用于测定同样的系是否已经获得,用于隔离环境或污染结果的溯源调查。

基因测序是菌种鉴定的重要手段。根据16S rRNA基因首500个碱基对的序列,并寻找匹配的序列数据库,可完成微生物的鉴别。Biosystems' MicroSeq系统设备已将DNA从微生物细胞中提取出来,并利用PCR进行扩增,对扩增产物进行循环测序,测试结果在基因分析器上读取,与系统数据库内16S rRNA序列进行比较,进行微生物鉴别。

芯片实验室是一个自动化的、微米级或纳米级实验室,能在单个微晶片上完成样品制备、流体处理、分析和检测等步骤。这种技术的基础是微流控技术。微流控技术控制着微型系统内微量的液体。微型系统是一个由蚀刻在玻璃或聚合物薄片上的通道和井构成的网络系统。通过很好地控制通道压力或电压,以pL或nL的体积梯度变化,实现样品的处理、混合、稀释、电泳、色谱分离、染色和检测。

芯片实验室可分析液体样品中的蛋白质、DNA、RNA和完整细胞。Bacterial Barcodes DiversiLab微生物分型系统就是这样的平台,利用微流控芯片(DNA LabChip)分离细菌基因组重复序列PCR(rep-PCR)扩增子,将这种芯片放入生物分析器,扩增子通过一个激光器,引起其间染料发荧光。所得rep-PCR指纹图谱结果与数据库比较,进行微生物检测或鉴别。

微阵列(microarrays),也称为生物芯片(biochips)或DNA芯片(DNA chips),是将多个微型实验单元集合在固体介质上,同时进行多个测试。微阵列是由有序排列在玻璃、硅片或尼龙物质上的蛋白质或数千个DNA或RNA片段组成。DNA片段附着在介质上,也可将探针直接合成在芯片上,并有荧光标记。

微阵列技术可用于鉴别核酸序列,测定基因的表达水平,如Affymetrix's GeneChip芯片上含有全部人类基因组(50,000个已知基因和基因变异);CombiMatrix's CustomArray含有的探针能检测A型流感和H5N1型禽流感。

STMicroelectronics’In-Check silicon chip芯片结合了微流控和微阵列技术,提供了必要的机械、热学、电学和流体连接。所用样品量为2~8μL,PCR反应比常规热循环仪快3倍,便携式、定制荧光检测读取器在几秒内完成微阵列分析。当前这种平台用于引起败血症的10种细菌和污染的血液培养样品中耐甲氧西林金葡菌的鉴别。
 
结语

其他检测方法尚有酶联免疫吸附试验(ELISA)、脂肪酸分析法、基质辅助激 光解吸离子飞行质谱(MALDI-TOF-MS)、表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱系统(SELDI-TOF MS)等。

与常规微生物检测技术相比,RMM的自动化或微型化程度高,提高了检测通量,更灵敏、更准确、更精确,重现性好,可明显缩短检测时间,从几天缩短到几小时,某些技术还可实现实时检测。微生物检测数据的实时获得,使得实验室的被动模式变为主动模式,可在正常生产操作期间,了解工艺过程和成品是否被污染。

RMM可用于以下工艺生产过程:原料和组分检查、在线工艺和预灭菌/过滤的微生物负荷检查、发酵和细胞培养的监测、纯化水/工艺用水检查、环境监测,如对表面、空气、压缩气体、人员的监测、微生物限度检查、抗菌效力检查、微生物指示剂残留研究、无菌检查、介质分装失败调查、污染事件的评估等。

以下介绍开展RMM的合规性问题。

美国FDA于2004年9月发布了《无菌工艺指南》,鼓励采用新的微生物检测方法和系统。指南中建议采用快速遗传学法鉴别微生物,研究显示这类方法比生化法和表型技术更准确,更精密。指南中还提到其他适用于环境监测、在线工艺控制的快速微生物测试方法。

目前药典,包括USP和EP都收载了关于RMM的通则。

“USP<1223>—替代微生物检测法的确认”,是关于药典收载的官方微生物检测法的替代方法的确认指南。其中引用“USP <1225>—药典收载方法的确认”的分析概念,并与替代方法的定性定量系统相结合。

“EP 5.1.6章—微生物质量控制替代法”中叙述了微生物质量控制替代法(EP, 2007),包括定性、定量、鉴别方法及确认所用标准,如准确度、精密度、专属性、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。有生物发光技术的替代方法确认方案的详尽示例。

《PDA技术报告33—新微生物检测方法的评估、确认和实施》一书中提供的验证指南,用于指导验证或新工艺确认。

国内企业若开展新的微生物检测鉴定,可参照以上有关法规及技术报告。


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