Caco-2细胞用于药物转运研究,需要注意这一点

生物通2019-04-14 07:23:24

药物的吸收首先需要通过小肠上皮细胞。来源于人结肠癌细胞的Caco-2细胞,在结构和功能上与人小肠上皮细胞相似,因此被广泛用作一种研究药物吸收、运输和代谢的体外模型。

在培养条件下,Caco-2细胞可形成与小肠上皮细胞相同的细胞极性和致密的单细胞层结构,分化出绒毛面A(apical,相当于肠腔侧)和基底面B(basolateral,相当于肠内壁侧)。由于这种性质,Caco-2细胞单层已成为研究药物吸收和转运的有效工具。


目前,制药行业正利用Caco-2细胞开展渗透性分析,以估计候选药物穿过小肠上皮的能力。Caco-2细胞模型的具体应用包括:研究口服药物是从A到B方向还是从B到A方向转运,并明确药物吸收是被动扩散还是主动转运,为给药方案提供依据。


当然,我们首先要培养Caco-2细胞。细胞通常被接种到Transwell或Snapwell小室中,这些小室分为上下层,中间以聚碳酸酯膜相隔,可配合多孔培养板使用。开展研究时,将待测化合物添加到细胞单层的A侧或B侧。孵育一定的时间后,测定化合物的浓度,并计算每种化合物的渗透速率。


早期,Caco-2细胞单层检测大多使用放射性标记的化合物,但如今大多数实验室已经采用液相色谱-质谱(LC-MS)和液相色谱-串联质谱(LC-MS-MS)。质谱的使用不仅避免了放射性标记的化合物,还可以同时测量多种化合物。


不过,需要注意的是,A侧或B侧的粗制样品提取物可能包含一些细胞碎片或颗粒物。这可能会引起HPLC柱的堵塞。因此,有必要对样品进行过滤。同时,必须注意过滤过程不能对样品产生不利影响,既不能截留了感兴趣的化合物,又不能让滤器本身的材料进入样品,让图谱无故多了几个峰。


因此,研究人员大多使用96孔滤板来进行样品澄清,以便在HPLC/MS之前去除细胞碎片或颗粒,同时又不损失目标分子。


Pall的AcroPrep Advance 96孔滤板就是一个不错的选择。它采用耐化学腐蚀的材质,为有机溶剂中样品的处理带来稳定的平台。聚丙烯的板子和GHP的膜材不会和DMSO发生相互作用,无需担心有机溶剂的污染。因此,它保证样品的完全回收以及低的非特异性结合。


此外,创新的小孔设计为你带来更快速的过滤,各孔流速一致,同时降低了死体积;出口端设计也经过优化,可以最大限度减少孵育过程中的样品泄漏,让样品直接流入接收板而无需担心交叉污染。


至于孔径的选择,与HPLC柱配合使用的大多数过滤器是0.45 μm孔径的。对于那些填料直径在5 μm或以上的HPLC柱,这是OK的,因为填料之间的空隙足够大,让0.45 μm以下的颗粒能够顺利通过。


AcroPrep Advance 96孔滤板除了提供0.2 μm和0.45 μm两种孔径的滤膜,还有三种不同规格可供选择:350 μL、1 mL和2 mL,分别适合300 μL、900 μL和1.9 mL的样品体积。


大家都知道,Caco-2细胞不好养,药物转运的实验不好做,也许,重视实验的每一个细节,最终才能获得漂亮的结果。



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